蛋白印迹实验封闭蛋白选哪种,牛奶或 BSA?
蛋白印迹实验封闭蛋白选哪种,牛奶或 BSA?
脱脂奶粉或牛血清白蛋白 (BSA) 会如何影响你的蛋白印迹结果。
关于蛋白印迹 WB 实验,我们常遇到一个问题,我该用什么来封闭,牛奶或 BSA?
首先,我们需要了解封闭的目的:减少因非特异性结合而产生的背景。其次,我们需要知道 BSA 和牛奶的区别:BSA 仅由一种蛋白组成,即 60 kDa 的牛血清白蛋白;而牛奶则由许多大小不一的蛋白构成。
所以,CST (Cell Signaling Technology) 推荐牛奶封闭最佳,因为牛奶有更大的机会来减少更多的非特异性结合。我们建议您用经 TBST 稀释的 5% 牛奶,在室温下摇晃一小时,来封闭CST所有非偶联一抗,这包括磷酸化特异性和总抗体。
现在,曾有同学问过,“牛奶中的磷酸酶会怎么样?” 或许有一些文章反对使用牛奶来检测磷酸化信号,这一误区的出现可能是由于实验者使用了非实验级奶粉引起的(国内许多奶粉含有磷酸酶等杂质),但在 CST 的所有内部检测中,科学家们进行了多次蛋白印迹实验,从未发现任何这样的问题。CST建议转膜后迅速在TBS中洗涤膜几秒,以便移除残留的转膜缓冲液,随后使用5%脱脂牛奶(请使用实验级的#9999)的TBST室温封闭1h。另外,CST科学家们每天至少要新鲜配制一次牛奶,有时甚至一天配制多次,因为如果牛奶缓冲液放置了一周、两周甚至更长时间不使用,那么磷酸酶影响信号的机率将会增加。
上图是(Phospho-Akt (Thr308) (D25E6) XP® Rabbit mAb) #13038 用来检测经 PDGF 处理的 3T3 细胞裂解物的结果图片。左侧膜是用牛奶封闭,右侧膜用 BSA 封闭。显然,用 BSA 封闭的膜的背景更高。但用牛奶封闭膜时,磷酸化信号仍然很强且清晰。
封闭后,请仔细查看一抗的说明书,根据推荐的一抗缓冲液来稀释一抗,一般推荐牛奶或 BSA,但取决于不同抗体。
希望本篇讲述的实验细节对您的实验有所帮助。全部特定应用的实验步骤可在 cst-c.com.cn 具体产品页上找到。如果你有任何其他技术问题,请邮件联系[email protected],或可拨打全国免费技术热线:4006-GreatQ(473287)。
本来来自 CST中国 CST博士互助平台
- 上一篇:内参蛋白,你选对了吗? 2020/3/18
- 下一篇:IHC 实验操作步骤 2020/3/18